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Es wurde ein ultrakompaktes (54 × 58 × 8,5 mm) Neunfarbenspektrometer mit großer Apertur (1 × 7 mm) entwickelt, das durch eine Anordnung von zehn dichroitischen Spiegeln „in zwei Teile geteilt“ wurde und für die sofortige Spektralbildgebung verwendet wurde.Der einfallende Lichtstrom mit einem Querschnitt kleiner als die Aperturgröße wird in einen durchgehenden Streifen von 20 nm Breite und neun Farbflüsse mit zentralen Wellenlängen von 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 und 690 nm aufgeteilt.Bilder von neun Farbströmen werden gleichzeitig effizient vom Bildsensor gemessen.Im Gegensatz zu herkömmlichen dichroitischen Spiegelarrays verfügt das entwickelte dichroitische Spiegelarray über eine einzigartige zweiteilige Konfiguration, die nicht nur die Anzahl der Farben erhöht, die gleichzeitig gemessen werden können, sondern auch die Bildauflösung für jeden Farbstrom verbessert.Das entwickelte Neunfarbenspektrometer wird für die Vierkapillarelektrophorese verwendet.Gleichzeitige quantitative Analyse von acht Farbstoffen, die gleichzeitig in jeder Kapillare wandern, mittels laserinduzierter Neunfarben-Fluoreszenz.Da das Neunfarben-Spektrometer nicht nur ultraklein und kostengünstig ist, sondern auch über einen hohen Lichtstrom und eine ausreichende spektrale Auflösung für die meisten Spektralbildgebungsanwendungen verfügt, kann es in verschiedenen Bereichen umfassend eingesetzt werden.
Hyperspektrale und multispektrale Bildgebung ist zu einem wichtigen Bestandteil der Astronomie2, Fernerkundung für die Erdbeobachtung3,4, Lebensmittel- und Wasserqualitätskontrolle5,6, Kunstkonservierung und Archäologie7, Forensik8, Chirurgie9, biomedizinische Analyse und Diagnostik10,11 usw. geworden. Bereich 1 Eine unverzichtbare Technologie ,12,13.Methoden zur Messung des Spektrums des von jedem Emissionspunkt im Sichtfeld emittierten Lichts werden in (1) Punktabtastung („Besen“)14,15 und (2) lineare Abtastung („Rispe“)16,17,18 unterteilt , (3) Länge scannt Wellen19,20,21 und (4) Bilder22,23,24,25.Bei all diesen Methoden besteht ein Kompromissverhältnis zwischen räumlicher Auflösung, spektraler Auflösung und zeitlicher Auflösung9,10,12,26.Darüber hinaus hat die Lichtleistung einen erheblichen Einfluss auf die Empfindlichkeit, also das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Spektralbildgebung26.Der Lichtstrom, also die Effizienz der Lichtnutzung, ist direkt proportional zum Verhältnis der tatsächlich gemessenen Lichtmenge jedes Leuchtpunkts pro Zeiteinheit zur Gesamtlichtmenge des gemessenen Wellenlängenbereichs.Kategorie (4) ist eine geeignete Methode, wenn sich die Intensität oder das Spektrum des von jedem Emissionspunkt emittierten Lichts mit der Zeit ändert oder wenn sich die Position jedes Emissionspunkts mit der Zeit ändert, da das Spektrum des von allen Emissionspunkten emittierten Lichts gleichzeitig gemessen wird.24.
Die meisten der oben genannten Methoden werden mit großen, komplexen und/oder teuren Spektrometern kombiniert, die 18 Gitter oder 14, 16, 22, 23 Prismen für die Klassen (1), (2) und (4) oder 20, 21 Filterscheiben und Flüssigkeitsfilter verwenden .Kristalline abstimmbare Filter (LCTF)25 oder akusto-optische abstimmbare Filter (AOTF)19 der Kategorie (3).Im Gegensatz dazu sind Multispiegelspektrometer der Kategorie (4) aufgrund ihrer einfachen Konfiguration klein und kostengünstig27,28,29,30.Darüber hinaus verfügen sie über einen hohen Lichtstrom, da das von jedem dichroitischen Spiegel geteilte Licht (d. h. das durchgelassene und reflektierte Licht des auf jeden dichroitischen Spiegel einfallenden Lichts) vollständig und kontinuierlich genutzt wird.Allerdings ist die Anzahl der gleichzeitig zu messenden Wellenlängenbänder (also Farben) auf etwa vier begrenzt.
Die auf Fluoreszenzdetektion basierende Spektralbildgebung wird häufig für Multiplexanalysen in der biomedizinischen Detektion und Diagnostik eingesetzt 10, 13 .Da beim Multiplexing mehrere Analyten (z. B. spezifische DNA oder Proteine) mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, wird jeder an jedem Emissionspunkt im Sichtfeld vorhandene Analyt mithilfe einer Mehrkomponentenanalyse quantifiziert.32 schlüsselt das erfasste Fluoreszenzspektrum auf, das von jedem Emissionspunkt emittiert wird.Während dieses Prozesses können verschiedene Farbstoffe, die jeweils eine unterschiedliche Fluoreszenz ausstrahlen, kolokalisieren, also räumlich und zeitlich koexistieren.Derzeit beträgt die maximale Anzahl an Farbstoffen, die mit einem einzelnen Laserstrahl angeregt werden können, acht33.Diese Obergrenze wird nicht durch die spektrale Auflösung (d. h. die Anzahl der Farben) bestimmt, sondern durch die Breite des Fluoreszenzspektrums (≥50 nm) und die Menge der Farbstoff-Stokes-Verschiebung (≤200 nm) bei FRET (unter Verwendung von FRET)10 .Allerdings muss die Anzahl der Farben größer oder gleich der Anzahl der Farbstoffe sein, um die spektrale Überlappung gemischter Farbstoffe zu beseitigen31,32.Daher ist es notwendig, die Anzahl der gleichzeitig gemessenen Farben auf acht oder mehr zu erhöhen.
Kürzlich wurde ein ultrakompaktes Heptachroit-Spektrometer (unter Verwendung einer Reihe heptachroitischer Spiegel und eines Bildsensors zur Messung von vier Fluoreszenzflüssen) entwickelt.Das Spektrometer ist zwei bis drei Größenordnungen kleiner als herkömmliche Spektrometer mit Gittern oder Prismen34,35.Allerdings ist es schwierig, mehr als sieben dichroitische Spiegel in einem Spektrometer zu platzieren und gleichzeitig mehr als sieben Farben zu messen36,37.Mit zunehmender Anzahl dichroitischer Spiegel nimmt der maximale Unterschied in den Längen der optischen Wege dichroitischer Lichtflüsse zu und es wird schwierig, alle Lichtflüsse auf einer sensorischen Ebene darzustellen.Auch die längste optische Weglänge des Lichtstroms nimmt zu, sodass die Breite der Spektrometerapertur (also die maximale Breite des vom Spektrometer analysierten Lichts) abnimmt.
Als Reaktion auf die oben genannten Probleme wurde ein ultrakompaktes Neunfarbenspektrometer mit einem zweischichtigen „dichroitischen“ dekachromatischen Spiegelarray und einem Bildsensor für die sofortige Spektralabbildung [Kategorie (4)] entwickelt.Im Vergleich zu früheren Spektrometern weist das entwickelte Spektrometer einen geringeren Unterschied in der maximalen optischen Weglänge und eine kleinere maximale optische Weglänge auf.Es wurde auf die Vier-Kapillar-Elektrophorese angewendet, um laserinduzierte Neunfarben-Fluoreszenz zu erkennen und die gleichzeitige Wanderung von acht Farbstoffen in jeder Kapillare zu quantifizieren.Da das entwickelte Spektrometer nicht nur ultraklein und kostengünstig ist, sondern auch über einen hohen Lichtstrom und eine ausreichende spektrale Auflösung für die meisten spektralen Bildgebungsanwendungen verfügt, kann es in verschiedenen Bereichen breit eingesetzt werden.
Das traditionelle Neunfarben-Spektrometer ist in Abb. dargestellt.1a.Sein Design folgt dem des bisherigen ultrakleinen Siebenfarben-Spektrometers 31. Es besteht aus neun dichroitischen Spiegeln, die horizontal in einem Winkel von 45° nach rechts angeordnet sind, und der Bildsensor (S) befindet sich über den neun dichroitischen Spiegeln.Das von unten einfallende Licht (C0) wird durch eine Anordnung von neun dichroitischen Spiegeln in neun nach oben gerichtete Lichtströme aufgeteilt (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 und C9).Alle neun Farbströme werden direkt dem Bildsensor zugeführt und gleichzeitig erfasst.In dieser Studie sind C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 und C9 in der Reihenfolge ihrer Wellenlänge angeordnet und werden durch Magenta, Violett, Blau, Cyan, Grün, Gelb, Orange, Rot-Orange und dargestellt rot bzw.Obwohl diese Farbbezeichnungen in diesem Dokument verwendet werden, wie in Abbildung 3 dargestellt, weichen sie von den tatsächlichen Farben ab, die das menschliche Auge sieht.
Schematische Darstellungen konventioneller und neuer Neunfarbenspektrometer.(a) Konventionelles Neunfarbenspektrometer mit einer Anordnung von neun dichroitischen Spiegeln.(b) Neues Neunfarben-Spektrometer mit einem zweischichtigen dichroitischen Spiegelarray.Der einfallende Lichtstrom C0 wird in neun farbige Lichtströme C1–C9 aufgeteilt und vom Bildsensor S erfasst.
Das entwickelte neue Neunfarben-Spektrometer verfügt über ein zweischichtiges dichroitisches Spiegelgitter und einen Bildsensor, wie in Abb. 1b dargestellt.In der unteren Ebene sind fünf dichroitische Spiegel um 45° nach rechts geneigt und von der Mitte der Dekameranordnung nach rechts ausgerichtet.Auf der obersten Ebene sind fünf zusätzliche dichroitische Spiegel um 45° nach links geneigt und von der Mitte nach links angeordnet.Der dichroitische Spiegel ganz links der unteren Schicht und der dichroitische Spiegel ganz rechts der oberen Schicht überlappen einander.Der einfallende Lichtstrom (C0) wird von unten durch fünf dichroitische Spiegel rechts in vier ausgehende chromatische Flüsse (C1-C4) und durch fünf dichroitische Spiegel links in fünf ausgehende chromatische Flüsse (C5-C4) aufgeteilt (C9).Wie bei herkömmlichen Neunfarbenspektrometern werden alle neun Farbströme direkt in den Bildsensor (S) eingespeist und gleichzeitig erfasst.Beim Vergleich der Abbildungen 1a und 1b erkennt man, dass sich beim neuen Neunfarbenspektrometer sowohl die maximale Differenz als auch die längste optische Weglänge der neun Farbflüsse halbieren.
Der detaillierte Aufbau eines ultrakleinen zweischichtigen dichroitischen Spiegelarrays von 29 mm (Breite) × 31 mm (Tiefe) × 6 mm (Höhe) ist in Abbildung 2 dargestellt. Das dezimale dichroitische Spiegelarray besteht rechts aus fünf dichroitischen Spiegeln (M1-M5) und fünf dichroitische Spiegel auf der linken Seite (M6-M9 und ein weiterer M5), jeder dichroitische Spiegel ist in der oberen Aluminiumhalterung befestigt.Alle dichroitischen Spiegel sind versetzt, um die Parallelverschiebung aufgrund der Brechung des Flusses durch die Spiegel auszugleichen.Unterhalb von M1 ist ein Bandpassfilter (BP) befestigt.Die Abmessungen von M1 und BP betragen 10 mm (lange Seite) x 1,9 mm (kurze Seite) x 0,5 mm (Dicke).Die Abmessungen der verbleibenden dichroitischen Spiegel betragen 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm.Der Matrixabstand zwischen M1 und M2 beträgt 1,7 mm, während der Matrixabstand anderer dichroitischer Spiegel 1,6 mm beträgt.Auf Abb.2c kombiniert den einfallenden Lichtfluss C0 und neun farbige Lichtflüsse C1–C9, getrennt durch eine Entkammerungsmatrix aus Spiegeln.
Aufbau einer zweischichtigen dichroitischen Spiegelmatrix.(a) Eine perspektivische Ansicht und (b) eine Querschnittsansicht einer zweischichtigen dichroitischen Spiegelanordnung (Abmessungen 29 mm x 31 mm x 6 mm).Es besteht aus fünf dichroitischen Spiegeln (M1–M5), die sich in der unteren Schicht befinden, fünf dichroitischen Spiegeln (M6–M9 und ein weiterer M5), die sich in der oberen Schicht befinden, und einem Bandpassfilter (BP), der sich unter M1 befindet.(c) Querschnittsansicht in vertikaler Richtung mit Überlappung von C0 und C1-C9.
Die Breite der Öffnung in horizontaler Richtung, angegeben durch die Breite C0 in Abb. 2, c, beträgt 1 mm und in der Richtung senkrecht zur Ebene von Abb. 2, c, gegeben durch die Konstruktion der Aluminiumhalterung, – 7 mm.Das heißt, das neue Neunfarben-Spektrometer hat eine große Aperturgröße von 1 mm × 7 mm.Der optische Weg von C4 ist der längste unter C1–C9, und der optische Weg von C4 innerhalb des dichroitischen Spiegelarrays beträgt aufgrund der oben genannten ultrakleinen Größe (29 mm × 31 mm × 6 mm) 12 mm.Gleichzeitig ist die optische Weglänge von C5 die kürzeste unter C1-C9 und die optische Weglänge von C5 beträgt 5,7 mm.Daher beträgt der maximale Unterschied in der optischen Weglänge 6,3 mm.Die oben genannten optischen Weglängen sind um die optische Weglänge für die optische Übertragung von M1-M9 und BP (von Quarz) korrigiert.
Die spektralen Eigenschaften von М1−М9 und VR werden so berechnet, dass die Flüsse С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8 und С9 im Wellenlängenbereich 520–540, 540–560, 560–580, 580 liegen –600, 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 bzw. 680–700 nm.
Ein Foto der hergestellten Matrix dekachromatischer Spiegel ist in Abb. 3a dargestellt.M1-M9 und BP sind jeweils auf die 45-Grad-Neigung und die horizontale Ebene des Aluminiumträgers geklebt, während M1 und BP auf der Rückseite der Figur verborgen sind.
Herstellung einer Reihe von Dekanspiegeln und deren Demonstration.(a) Eine Reihe hergestellter dekachromatischer Spiegel.(b) Ein 1 mm × 7 mm großes Neunfarben-Splitbild, das auf ein Blatt Papier projiziert wird, das vor einer Reihe dekachromatischer Spiegel platziert und mit weißem Licht hinterleuchtet wird.(c) Eine Reihe dechromatischer Spiegel, die von hinten mit weißem Licht beleuchtet werden.(d) Neunfarbiger Spaltstrom, der von der Decan-Spiegelanordnung ausgeht, beobachtet durch Platzieren eines mit Rauch gefüllten Acrylkanisters vor der Decan-Spiegelanordnung bei c und Abdunkeln des Raums.
Die gemessenen Transmissionsspektren von M1-M9 C0 bei einem Einfallswinkel von 45° und das gemessene Transmissionsspektrum von BP C0 bei einem Einfallswinkel von 0° sind in den Abbildungen dargestellt.4a.Die Transmissionsspektren von C1-C9 relativ zu C0 sind in den Abbildungen dargestellt.4b.Diese Spektren wurden aus den Spektren in den Abbildungen berechnet.4a entsprechend dem Strahlengang C1-C9 in Abb. 4a.1b und 2c.Zum Beispiel: TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS(C9) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], wobei TS(X) und [ 1 − TS(X)] sind die Transmissions- bzw. Reflexionsspektren von X.Wie in Abbildung 4b dargestellt, betragen die Bandbreiten (Bandbreite ≥50 %) von C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 und C9 521–540, 541–562, 563–580, 581–602, 603 -623, 624-641, 642-657, 659-680 und 682-699 nm.Diese Ergebnisse stimmen mit den entwickelten Bereichen überein.Darüber hinaus ist die Nutzungseffizienz von C0-Licht hoch, d. h. die durchschnittliche maximale C1-C9-Lichtdurchlässigkeit beträgt 92 %.
Transmissionsspektren eines dichroitischen Spiegels und eines geteilten Neunfarbenflusses.(a) Gemessene Transmissionsspektren von M1-M9 bei 45°-Einfall und BP bei 0°-Einfall.(b) Transmissionsspektren von C1–C9 relativ zu C0, berechnet aus (a).
Auf Abb.In 3c ist die Anordnung dichroitischer Spiegel vertikal angeordnet, so dass ihre rechte Seite in Abb. 3a die Oberseite ist und der weiße Strahl der kollimierten LED (C0) von hinten beleuchtet wird.Die in Abbildung 3a gezeigte Anordnung dekachromatischer Spiegel ist in einem Adapter von 54 mm (Höhe) × 58 mm (Tiefe) × 8,5 mm (Dicke) montiert.Auf Abb.3d, zusätzlich zu dem in Abb. 3d gezeigten Zustand.In 3c wurde ein mit Rauch gefüllter Acryltank vor einer Reihe dechromatischer Spiegel platziert, während die Lichter im Raum ausgeschaltet waren.Dadurch sind im Tank neun dichroitische Ströme sichtbar, die von einer Reihe dekatroischer Spiegel ausgehen.Jeder Splitstream hat einen rechteckigen Querschnitt mit Abmessungen von 1 × 7 mm, was der Aperturgröße des neuen Neunfarben-Spektrometers entspricht.In Abbildung 3b wird ein Blatt Papier vor die Anordnung dichroitischer Spiegel in Abbildung 3c gelegt und ein 1 x 7 mm großes Bild von neun dichroitischen Strömen, die auf das Papier projiziert werden, wird aus der Richtung der Papierbewegung beobachtet.Ströme.Die neun Farbseparationsströme in Abb.3b und d sind C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 und C9 von oben nach unten, was auch in den Abbildungen 1 und 2 zu sehen ist. 1b und 2c.Sie werden in den Farben beobachtet, die ihren Wellenlängen entsprechen.Aufgrund der geringen Weißlichtintensität der LED (siehe ergänzende Abbildung S3) und der Empfindlichkeit der Farbkamera, die zur Erfassung von C9 (682–699 nm) in Abb. verwendet wird, sind andere Aufteilungsströme schwach.Ebenso war C9 mit bloßem Auge schwach sichtbar.Unterdessen sieht C2 (der zweite Strom von oben) in Abbildung 3 grün aus, sieht mit bloßem Auge jedoch eher gelb aus.
Der Übergang von Abbildung 3c zu d ist im Zusatzvideo 1 dargestellt. Unmittelbar nachdem das weiße Licht der LED die dekachromatische Spiegelanordnung passiert hat, teilt es sich gleichzeitig in neun Farbströme auf.Am Ende löste sich der Rauch im Bottich nach und nach von oben nach unten auf, so dass auch die neun farbigen Pulver von oben nach unten verschwanden.Im Zusatzvideo 2 hingegen wurde die Wellenlänge des auf die Reihe dekachromatischer Spiegel einfallenden Lichtflusses von lang auf kurz in der Größenordnung von 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 und 532 nm geändert ., Es werden nur die entsprechenden Split-Streams der neun Split-Streams in der Reihenfolge C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 und C1 angezeigt.Das Acrylreservoir wird durch ein Quarzbecken ersetzt, und die Flocken jeder Nebenströmung können aus der abfallenden Aufwärtsrichtung deutlich beobachtet werden.Darüber hinaus wird das Untervideo 3 so bearbeitet, dass der Wellenlängenänderungsabschnitt des Untervideos 2 wiedergegeben wird.Dies ist der beredteste Ausdruck der Eigenschaften einer dechromatischen Spiegelanordnung.
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass das hergestellte dekachromatische Spiegelarray bzw. das neue Neunfarben-Spektrometer wie vorgesehen funktioniert.Das neue Neunfarben-Spektrometer entsteht durch die Montage einer Reihe dekachromatischer Spiegel mit Adaptern direkt auf der Bildsensorplatine.
Lichtstrom mit einem Wellenlängenbereich von 400 bis 750 nm, emittiert von vier Strahlungspunkten φ50 μm, die in Abständen von 1 mm in der Richtung senkrecht zur Ebene von Abb. 2c bzw. Forschungen 31, 34 angeordnet sind. Das Vier-Linsen-Array besteht aus vier Linsen φ1 mm mit einer Brennweite von 1,4 mm und einem Abstand von 1 mm.Vier kollimierte Ströme (vier C0) treffen im Abstand von 1 mm auf den DP eines neuen Neunfarben-Spektrometers.Eine Reihe dichroitischer Spiegel teilt jeden Strom (C0) in neun Farbströme (C1-C9).Die resultierenden 36 Ströme (vier Sätze von C1–C9) werden dann direkt in einen CMOS (S)-Bildsensor eingespeist, der direkt mit einem Array dichroitischer Spiegel verbunden ist.Infolgedessen wurden, wie in Abb. 5a dargestellt, aufgrund der geringen maximalen optischen Wegdifferenz und des kurzen maximalen optischen Wegs die Bilder aller 36 Ströme gleichzeitig und klar mit der gleichen Größe erfasst.Den Downstream-Spektren zufolge (siehe ergänzende Abbildung S4) ist die Bildintensität der vier Gruppen C1, C2 und C3 relativ gering.Sechsunddreißig Bilder hatten eine Größe von 0,57 ± 0,05 mm (Mittelwert ± SD).Somit betrug die Bildvergrößerung durchschnittlich 11,4.Der vertikale Abstand zwischen den Bildern beträgt durchschnittlich 1 mm (gleicher Abstand wie bei einer Linsenanordnung) und der horizontale Abstand durchschnittlich 1,6 mm (gleicher Abstand wie bei einer dichroitischen Spiegelanordnung).Da die Bildgröße viel kleiner ist als der Abstand zwischen den Bildern, kann jedes Bild unabhängig gemessen werden (mit geringem Übersprechen).In der Zwischenzeit sind Bilder von 28 Strömen, die mit dem in unserer vorherigen Studie verwendeten herkömmlichen Siebenfarbenspektrometer aufgezeichnet wurden, in Abb. 5 B dargestellt. Die Anordnung aus sieben dichroitischen Spiegeln wurde erstellt, indem die beiden ganz rechten dichroitischen Spiegel aus der Anordnung aus neun dichroitischen Spiegeln entfernt wurden Spiegel in Abbildung 1a.Nicht alle Bilder sind scharf, die Bildgröße steigt von C1 auf C7.28 Bilder haben eine Größe von 0,70 ± 0,19 mm.Daher ist es schwierig, bei allen Bildern eine hohe Bildauflösung aufrechtzuerhalten.Der Variationskoeffizient (CV) für Bildgröße 28 in Abbildung 5b betrug 28 %, während der CV für Bildgröße 36 in Abbildung 5a auf 9 % sank.Die obigen Ergebnisse zeigen, dass das neue Neunfarben-Spektrometer nicht nur die Anzahl der gleichzeitig gemessenen Farben von sieben auf neun erhöht, sondern auch eine hohe Bildauflösung für jede Farbe aufweist.
Vergleich der Qualität des geteilten Bildes, das von konventionellen und neuen Spektrometern erzeugt wird.(a) Vier Gruppen von neunfarbigen getrennten Bildern (C1-C9), die vom neuen Neunfarben-Spektrometer erzeugt wurden.(b) Vier Sätze von siebenfarbigen, getrennten Bildern (C1–C7), die mit einem herkömmlichen Siebenfarbenspektrometer erstellt wurden.Flüsse (C0) mit Wellenlängen von 400 bis 750 nm von vier Emissionspunkten werden kollimiert und treffen jeweils auf jedes Spektrometer.
Die spektralen Eigenschaften des Neunfarbenspektrometers wurden experimentell ausgewertet und die Auswertungsergebnisse sind in Abbildung 6 dargestellt. Beachten Sie, dass Abbildung 6a die gleichen Ergebnisse wie Abbildung 5a zeigt, dh bei Wellenlängen von 4 C0 400–750 nm werden alle 36 Bilder erfasst (4 Gruppen C1–C9).Im Gegensatz dazu gibt es, wie in Abb. 6b–j gezeigt, wenn jedes C0 eine spezifische Wellenlänge von 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 oder 690 nm hat, fast nur vier entsprechende Bilder (vier). Gruppen erkannt C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 oder C9).Einige der Bilder neben den vier entsprechenden Bildern werden jedoch nur sehr schwach erkannt, da sich die in Abb. 4b gezeigten C1–C9-Transmissionsspektren leicht überlappen und jedes C0 ein 10-nm-Band bei einer bestimmten Wellenlänge aufweist, wie in der Methode beschrieben.Diese Ergebnisse stimmen mit den in den Abbildungen gezeigten C1-C9-Transmissionsspektren überein.4b und ergänzende Videos 2 und 3. Mit anderen Worten, das Neun-Farben-Spektrometer funktioniert wie erwartet, basierend auf den in Abb. gezeigten Ergebnissen.4b.Daher wird der Schluss gezogen, dass die Bildintensitätsverteilung C1-C9 das Spektrum jedes C0 ist.
Spektrale Eigenschaften eines Neunfarbenspektrometers.Das neue Neunfarben-Spektrometer erzeugt vier Sätze getrennter Neunfarbenbilder (C1–C9), wenn das einfallende Licht (vier C0) eine Wellenlänge von (a) 400–750 nm hat (wie in Abbildung 5a dargestellt), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, jeweils.
Das entwickelte Neunfarbenspektrometer wurde für die Vierkapillarelektrophorese verwendet (Einzelheiten siehe ergänzende Materialien)31,34,35.Die Vier-Kapillar-Matrix besteht aus vier Kapillaren (Außendurchmesser 360 μm und Innendurchmesser 50 μm), die in Abständen von 1 mm an der Laserbestrahlungsstelle angeordnet sind.Proben, die DNA-Fragmente enthalten, die mit 8 Farbstoffen markiert sind, nämlich FL-6C (Farbstoff 1), JOE-6C (Farbstoff 2), dR6G (Farbstoff 3), TMR-6C (Farbstoff 4), CXR-6C (Farbstoff 5), TOM- 6C (Farbstoff 6), LIZ (Farbstoff 7) und WEN (Farbstoff 8) in aufsteigender Reihenfolge der Fluoreszenzwellenlänge, getrennt in jeder der vier Kapillaren (im Folgenden als Cap1, Cap2, Cap3 und Cap4 bezeichnet).Die laserinduzierte Fluoreszenz von Cap1-Cap4 wurde mit einer Anordnung von vier Linsen kollimiert und gleichzeitig mit einem Neunfarben-Spektrometer aufgezeichnet.Die Intensitätsdynamik der Neunfarben-Fluoreszenz (C1-C9) während der Elektrophorese, d. h. ein Neunfarben-Elektrophoregramm jeder Kapillare, ist in Abb. 7a dargestellt.Ein äquivalentes Neunfarben-Elektrophoregramm wird in Cap1-Cap4 erhalten.Wie durch die Cap1-Pfeile in Abbildung 7a angezeigt, zeigen die acht Peaks in jedem Neunfarben-Elektrophoregramm jeweils eine Fluoreszenzemission von Dye1-Dye8.
Gleichzeitige Quantifizierung von acht Farbstoffen mit einem Neunfarben-Vierkapillar-Elektrophorese-Spektrometer.(a) Neunfarben-Elektrophoregramm (C1-C9) jeder Kapillare.Die durch die Pfeile Cap1 gekennzeichneten acht Peaks zeigen einzelne Fluoreszenzemissionen von acht Farbstoffen (Dye1-Dye8).Die Farben der Pfeile entsprechen den Farben (b) und (c).(b) Fluoreszenzspektren von acht Farbstoffen (Dye1-Dye8) pro Kapillare.c Elektropherogramme von acht Farbstoffen (Dye1-Dye8) pro Kapillare.Die Peaks der mit Dye7 markierten DNA-Fragmente sind durch Pfeile gekennzeichnet, und ihre Cap4-Basenlängen sind angegeben.
Die Intensitätsverteilungen von C1–C9 auf acht Peaks sind in den Abbildungen dargestellt.7b bzw.Da sowohl C1-C9 als auch Dye1-Dye8 in der Wellenlängenreihenfolge vorliegen, zeigen die acht Verteilungen in Abb. 7b die Fluoreszenzspektren von Dye1-Dye8 der Reihe nach von links nach rechts.In dieser Studie erscheinen Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 und Dye8 in den Farben Magenta, Violett, Blau, Cyan, Grün, Gelb, Orange und Rot.Beachten Sie, dass die Farben der Pfeile in Abb. 7a den Farbstofffarben in Abb. 7b entsprechen.Die C1-C9-Fluoreszenzintensitäten für jedes Spektrum in Abbildung 7b wurden normalisiert, sodass ihre Summe gleich eins ist.Acht äquivalente Fluoreszenzspektren wurden von Cap1-Cap4 erhalten.Man kann deutlich die spektrale Überlappung der Fluoreszenz zwischen Farbstoff 1 und Farbstoff 8 beobachten.
Wie in Abbildung 7c dargestellt, wurde für jede Kapillare das Neunfarben-Elektrophoregramm in Abbildung 7a durch Mehrkomponentenanalyse basierend auf den acht Fluoreszenzspektren in Abbildung 7b in ein Achtfarben-Elektropherogramm umgewandelt (Einzelheiten siehe ergänzende Materialien).Da die spektrale Überlappung der Fluoreszenz in Abbildung 7a in Abbildung 7c nicht dargestellt ist, kann Dye1-Dye8 zu jedem Zeitpunkt einzeln identifiziert und quantifiziert werden, auch wenn unterschiedliche Mengen an Dye1-Dye8 gleichzeitig fluoreszieren.Dies ist mit der herkömmlichen Sieben-Farben-Erkennung31 nicht möglich, wohl aber mit der entwickelten Neun-Farben-Erkennung.Wie durch die Pfeile Cap1 in Abb. 7c dargestellt, sind nur die Fluoreszenzemissionssinguletts Dye3 (blau), Dye8 (rot), Dye5 (grün), Dye4 (cyan), Dye2 (lila), Dye1 (magenta) und Dye6 (gelb) vorhanden ) werden in der erwarteten chronologischen Reihenfolge beobachtet.Für die Fluoreszenzemission des Farbstoffs 7 (orange) wurden zusätzlich zu dem durch den orangefarbenen Pfeil angezeigten Einzelpeak mehrere weitere Einzelpeaks beobachtet.Dieses Ergebnis ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Proben Größenstandards, Dye7-markierte DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Basenlängen, enthielten.Wie in Abbildung 7c dargestellt, betragen diese Basislängen für Cap4 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 und 220 Basislängen.
Die Hauptmerkmale des Neunfarben-Spektrometers, das mithilfe einer Matrix zweischichtiger dichroitischer Spiegel entwickelt wurde, sind seine geringe Größe und sein einfaches Design.Da die Anordnung der dekachromatischen Spiegel im Inneren des Adapters in Abb.3c direkt auf der Bildsensorplatine montiert (siehe Abb. S1 und S2), hat das Neunfarben-Spektrometer die gleichen Abmessungen wie der Adapter, also 54 × 58 × 8,5 mm.(Dicke) .Diese ultrakleine Größe ist zwei bis drei Größenordnungen kleiner als herkömmliche Spektrometer, die Gitter oder Prismen verwenden.Da das Neunfarben-Spektrometer außerdem so konfiguriert ist, dass Licht senkrecht auf die Oberfläche des Bildsensors trifft, kann dem Neunfarben-Spektrometer in Systemen wie Mikroskopen, Durchflusszytometern oder Analysegeräten problemlos Platz zugewiesen werden.Kapillargitter-Elektrophorese-Analysator für eine noch stärkere Miniaturisierung des Systems.Gleichzeitig beträgt die Größe der zehn im Neunfarbenspektrometer verwendeten dichroitischen Spiegel und Bandpassfilter nur 10×1,9×0,5 mm bzw. 15×1,9×0,5 mm.Somit können aus einem dichroitischen Spiegel bzw. einem 60 mm2 großen Bandpassfilter mehr als 100 solcher kleiner dichroitischer Spiegel bzw. Bandpassfilter geschnitten werden.Daher kann eine Anordnung dekachromatischer Spiegel zu geringen Kosten hergestellt werden.
Ein weiteres Merkmal des Neunfarben-Spektrometers sind seine hervorragenden spektralen Eigenschaften.Insbesondere ermöglicht es die Aufnahme von Spektralbildern von Schnappschüssen, also die gleichzeitige Aufnahme von Bildern mit spektralen Informationen.Für jedes Bild wurde ein kontinuierliches Spektrum mit einem Wellenlängenbereich von 520 bis 700 nm und einer Auflösung von 20 nm erhalten.Mit anderen Worten: Für jedes Bild werden neun Farbintensitäten des Lichts erfasst, dh neun 20-nm-Bänder, die den Wellenlängenbereich von 520 bis 700 nm gleichmäßig aufteilen.Durch Ändern der spektralen Eigenschaften des dichroitischen Spiegels und des Bandpassfilters können der Wellenlängenbereich der neun Bänder und die Breite jedes Bandes angepasst werden.Die Neunfarbenerkennung kann nicht nur für Fluoreszenzmessungen mit spektraler Bildgebung (wie in diesem Bericht beschrieben) verwendet werden, sondern auch für viele andere gängige Anwendungen mit spektraler Bildgebung.Obwohl die hyperspektrale Bildgebung Hunderte von Farben erkennen kann, wurde festgestellt, dass selbst bei einer erheblichen Reduzierung der Anzahl erkennbarer Farben mehrere Objekte im Sichtfeld für viele Anwendungen mit ausreichender Genauigkeit identifiziert werden können38,39,40.Da räumliche Auflösung, spektrale Auflösung und zeitliche Auflösung bei der spektralen Bildgebung einen Kompromiss haben, kann eine Reduzierung der Anzahl der Farben die räumliche und zeitliche Auflösung verbessern.Es können auch einfache Spektrometer wie das in dieser Studie entwickelte verwendet werden, wodurch der Rechenaufwand weiter reduziert wird.
In dieser Studie wurden acht Farbstoffe gleichzeitig durch spektrale Trennung ihrer überlappenden Fluoreszenzspektren basierend auf der Erkennung von neun Farben quantifiziert.Es können bis zu neun Farbstoffe gleichzeitig quantifiziert werden, die zeitlich und räumlich nebeneinander existieren.Ein besonderer Vorteil des Neunfarben-Spektrometers ist sein hoher Lichtstrom und die große Apertur (1 × 7 mm).Das Decan-Spiegelarray hat in jedem der neun Wellenlängenbereiche eine maximale Transmission von 92 % des Lichts aus der Apertur.Die Effizienz der Nutzung von einfallendem Licht im Wellenlängenbereich von 520 bis 700 nm beträgt nahezu 100 %.In einem so breiten Wellenlängenbereich kann kein Beugungsgitter eine so hohe Nutzungseffizienz bieten.Selbst wenn die Beugungseffizienz eines Beugungsgitters bei einer bestimmten Wellenlänge 90 % übersteigt, nimmt die Beugungseffizienz bei einer anderen Wellenlänge mit zunehmender Differenz zwischen dieser Wellenlänge und einer bestimmten Wellenlänge ab41.Die Öffnungsweite senkrecht zur Richtung der Ebene in Abb. 2c kann durch leichte Modifikation des Decamer-Arrays von 7 mm auf die Breite des Bildsensors erweitert werden, wie im Fall des in dieser Studie verwendeten Bildsensors.
Das Neunfarbenspektrometer kann nicht nur, wie in dieser Studie gezeigt, für die Kapillarelektrophorese eingesetzt werden, sondern auch für verschiedene andere Zwecke.Wie in der Abbildung unten gezeigt, kann beispielsweise ein Neunfarbenspektrometer auf ein Fluoreszenzmikroskop angewendet werden.Die Probenebene wird durch ein 10-fach-Objektiv auf dem Bildsensor des Neunfarbenspektrometers abgebildet.Der optische Abstand zwischen Objektivlinse und Bildsensor beträgt 200 mm, während der optische Abstand zwischen der Einfallsfläche des Neunfarbenspektrometers und dem Bildsensor nur 12 mm beträgt.Daher wurde das Bild auf etwa die Größe der Apertur (1 × 7 mm) in der Einfallsebene zugeschnitten und in neun Farbbilder aufgeteilt.Das heißt, ein Spektralbild eines Neunfarben-Schnappschusses kann auf einer Fläche von 0,1 x 0,7 mm in der Probenebene aufgenommen werden.Darüber hinaus ist es möglich, ein Neunfarben-Spektralbild eines größeren Bereichs auf der Probenebene zu erhalten, indem die Probe relativ zum Objektiv in horizontaler Richtung in Abb. 2c abgetastet wird.
Die dekachromatischen Spiegelarray-Komponenten, nämlich M1-M9 und BP, wurden von Asahi Spectra Co., Ltd. unter Verwendung von Standard-Fällungsmethoden maßgeschneidert.Mehrschichtige dielektrische Materialien wurden einzeln auf zehn Quarzplatten mit einer Größe von 60 × 60 mm und einer Dicke von 0,5 mm aufgetragen und erfüllten die folgenden Anforderungen: M1: IA = 45°, R ≥ 90 % bei 520–590 nm, Tave ≥ 90 % bei 610– 610 nm.700 nm, M2: IA = 45°, R ≥ 90 % bei 520–530 nm, Tave ≥ 90 % bei 550–600 nm, M3: IA = 45°, R ≥ 90 % bei 540–550 nm, Tave ≥ 90 % bei 570–600 nm, M4: IA = 45°, R ≥ 90 % bei 560–570 nm, Tave ≥ 90 % bei 590–600 nm, M5: IA = 45°, R ≥ 98 % bei 580–600 nm , R ≥ 98 % bei 680–700 nm, M6: IA = 45°, Tave ≥ 90 % bei 600–610 nm, R ≥ 90 % bei 630–700 nm, M7: IA = 45°, R ≥ 90 % bei 620–630 nm, Taw ≥ 90 % bei 650–700 nm, M8: IA = 45°, R ≥ 90 % bei 640–650 nm, Taw ≥ 90 % bei 670–700 nm, M9: IA = 45°, R ≥ 90 % bei 650–670 nm, Tave ≥ 90 % bei 690–700 nm, BP: IA = 0°, T ≤ 0,01 % bei 505 nm, Tave ≥ 95 % bei 530–690 nm bei 530 nm T ≥ 90 % bei -690 nm und T ≤ 1 % bei 725–750 nm, wobei IA, T, Tave und R der Einfallswinkel, die Durchlässigkeit, die durchschnittliche Durchlässigkeit und das Reflexionsvermögen für unpolarisiertes Licht sind.
Weißes Licht (C0) mit einem Wellenlängenbereich von 400–750 nm, das von einer LED-Lichtquelle (AS 3000, AS ONE CORPORATION) emittiert wurde, wurde kollimiert und fiel vertikal auf den DP einer Anordnung dichroitischer Spiegel.Das Weißlichtspektrum von LEDs ist in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.Platzieren Sie einen Acryltank (Abmessungen 150 × 150 × 30 mm) direkt vor der Dekamera-Spiegelanordnung gegenüber dem Netzteil.Der Rauch, der beim Eintauchen von Trockeneis in Wasser entstand, wurde dann in einen Acryltank gegossen, um die neunfarbigen C1-C9-Spaltströme zu beobachten, die von der Reihe dekachromatischer Spiegel ausgingen.
Alternativ wird das kollimierte weiße Licht (C0) vor dem Eintritt in den DP durch einen Filter geleitet.Bei den Filtern handelte es sich ursprünglich um Neutraldichtefilter mit einer optischen Dichte von 0,6.Verwenden Sie dann einen motorisierten Filter (FW212C, FW212C, Thorlabs).Zum Schluss schalten Sie den ND-Filter wieder ein.Die Bandbreiten der neun Bandpassfilter entsprechen C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 und C1.Eine Quarzzelle mit Innenabmessungen von 40 (optische Länge) x 42,5 (Höhe) x 10 mm (Breite) wurde vor einer Reihe dechromatischer Spiegel gegenüber dem BP platziert.Der Rauch wird dann durch ein Rohr in die Quarzzelle geleitet, um die Rauchkonzentration in der Quarzzelle aufrechtzuerhalten und die neunfarbigen C1-C9-Spaltströme sichtbar zu machen, die von der dekachromatischen Spiegelanordnung ausgehen.
Ein Video des neunfarbigen geteilten Lichtstroms, der von einer Reihe dekanischer Spiegel ausgeht, wurde im Zeitraffermodus auf dem iPhone XS aufgenommen.Nehmen Sie Bilder der Szene mit 1 fps auf und kompilieren Sie die Bilder, um Videos mit 30 fps (für optionales Video 1) oder 24 fps (für optionale Videos 2 und 3) zu erstellen.
Legen Sie eine 50 µm dicke Edelstahlplatte (mit vier Löchern mit 50 µm Durchmesser in Abständen von 1 mm) auf die Diffusionsplatte.Licht mit einer Wellenlänge von 400–750 nm wird auf die Diffusorplatte gestrahlt, indem Licht von einer Halogenlampe durch einen kurzen Transmissionsfilter mit einer Grenzwellenlänge von 700 nm geleitet wird.Das Lichtspektrum ist in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt.Alternativ passiert das Licht auch einen der 10-nm-Bandpassfilter mit der Mitte bei 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 und 690 nm und trifft auf die Diffusorplatte.Dadurch wurden auf einer Edelstahlplatte gegenüber der Diffusorplatte vier Strahlungspunkte mit einem Durchmesser von 50 μm und unterschiedlichen Wellenlängen gebildet.
Ein Vier-Kapillar-Array mit vier Linsen ist auf einem Neunfarben-Spektrometer montiert, wie in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. C1 und C2.Die vier Kapillaren und vier Linsen waren die gleichen wie in früheren Studien31,34.Ein Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 505 nm und einer Leistung von 15 mW wird gleichzeitig und gleichmäßig von der Seite auf die Emissionspunkte von vier Kapillaren eingestrahlt.Die von jedem Emissionspunkt emittierte Fluoreszenz wird durch die entsprechende Linse kollimiert und durch eine Reihe dekachromatischer Spiegel in neun Farbströme aufgeteilt.Die resultierenden 36 Streams wurden dann direkt in einen CMOS-Bildsensor (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.) eingespeist und ihre Bilder gleichzeitig aufgezeichnet.
ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), 4 µl GeneScan™ 600 LIZ™ Farbstoff wurden für jede Kapillare durch Mischen von 1 µl PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation) und 1 µl Mix-Size-Standard gemischt.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) und 14 µl Wasser.Der PowerPlex® 6C Matrix Standard besteht aus sechs DNA-Fragmenten, die mit sechs Farbstoffen markiert sind: FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C und WEN, in der Reihenfolge der maximalen Wellenlänge.Die Basenlängen dieser DNA-Fragmente werden nicht offengelegt, aber die Basenlängensequenz der mit WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C und TOM-6C markierten DNA-Fragmente ist bekannt.Die Mischung im ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit enthält ein mit dR6G-Farbstoff markiertes DNA-Fragment.Auch die Längen der Basen der DNA-Fragmente werden nicht bekannt gegeben.GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 enthält 36 LIZ-markierte DNA-Fragmente.Die Basenlängen dieser DNA-Fragmente betragen 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340. 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 und 600 Basis.Die Proben wurden 3 Minuten lang bei 94 °C denaturiert und dann 5 Minuten lang auf Eis gekühlt.Proben wurden 9 s lang mit 26 V/cm in jede Kapillare injiziert und in jeder Kapillare getrennt, die mit einer POP-7™-Polymerlösung (Thermo Fisher Scientific) mit einer effektiven Länge von 36 cm und einer Spannung von 181 V/cm und einem gefüllt war Winkel von 60°.AUS.
Alle im Rahmen dieser Studie gewonnenen oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und den dazugehörigen Zusatzinformationen enthalten.Weitere für diese Studie relevante Daten sind auf begründete Anfrage bei den jeweiligen Autoren erhältlich.
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Zeitpunkt der Veröffentlichung: 10. Januar 2023